Kính hiển vi là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Giới thiệu chung về kính hiển vi

Kính hiển vi là dụng cụ quang học hoặc điện tử được thiết kế nhằm khuếch đại hình ảnh của đối tượng nhỏ qua hệ thống thấu kính hoặc chùm electron. Mục đích chính là quan sát chi tiết cấu trúc vi mô không thể nhìn thấy bằng mắt thường, từ tế bào sinh học đến vật liệu nano. Kính hiển vi đóng vai trò nền tảng trong nghiên cứu khoa học, y sinh, công nghiệp bán dẫn và vật liệu.

Lịch sử phát triển kính hiển vi bắt đầu từ cuối thế kỷ XVI với công trình của Hans và Zacharias Janssen—nhà sản xuất kính Hà Lan—khi họ ghép hai thấu kính để phóng đại vật thể nhỏ. Qua các thế kỷ, kính hiển vi quang học tiếp tục cải tiến về chất liệu thấu kính, thiết kế cơ khí và hệ thống chiếu sáng. Đến thế kỷ XX, kính hiển vi điện tử ra đời, mở ra kỷ nguyên quan sát độ phân giải sub-nanomet.

Trong y sinh, kính hiển vi là công cụ không thể thiếu để phân tích tế bào, mô bệnh học và vi sinh vật. Trong ngành công nghiệp, kính hiển vi được ứng dụng để kiểm tra mạch tích hợp, bề mặt vật liệu và khuyết tật sản phẩm. Sự phát triển của kính hiển vi còn thúc đẩy các công nghệ liên quan như nhuộm huỳnh quang, chụp ảnh 3D và phân tích phổ vật liệu.

• Nghiên cứu sinh học: quan sát cấu trúc tế bào, vi khuẩn, virus
• Mô bệnh học: soi tiêu bản sinh thiết, phát hiện ung thư
• Công nghiệp: kiểm tra chip bán dẫn, phân tích bề mặt vật liệu
• Giáo dục: giảng dạy sinh học, khoa học vật liệu

Các loại kính hiển vi

Kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến truyền qua hoặc phản xạ từ mẫu để tạo ảnh. Các biến thể phổ biến bao gồm kính hiển vi sáng truyền (bright-field), hiển vi tương phản pha (phase-contrast) và hiển vi huỳnh quang (fluorescence). Mỗi kỹ thuật tối ưu cho nhu cầu khác nhau: bright-field cho mẫu nhuộm, phase-contrast cho mẫu sống không nhuộm, huỳnh quang cho tín hiệu phát quang gắn miễn dịch.

Kính hiển vi điện tử dùng chùm electron với bước sóng cực ngắn, cho độ phân giải vượt xa giới hạn nhiễu xạ của ánh sáng. TEM truyền electron qua mẫu siêu mỏng để ghi nhận cường độ electron xuyên qua, tái tạo cấu trúc nội quan; SEM quét bề mặt mẫu, ghi lại electron thứ phát để dựng ảnh 3D bề mặt.

Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) và kính hiển vi quét đầu dò (SPM) đo tương tác lực hoặc dòng điện giữa đầu dò cực nhỏ và bề mặt mẫu. Kỹ thuật này cho phép khảo sát topography bề mặt ở cấp độ nguyên tử mà không cần nhuộm hay xử lý mẫu phức tạp.

Nguyên lý quang học của kính hiển vi sáng truyền

Trong kính hiển vi sáng truyền, sóng ánh sáng đi qua mẫu mỏng, bị tán sắc hoặc khúc xạ tại biên giao mô, tạo ra tương phản hình ảnh. Hệ thống thấu kính gồm vật kính (objective) gần mẫu, thu ánh sáng hội tụ, và thị kính (eyepiece) phóng đại sơ cấp trước khi mắt người quan sát hoặc camera ghi nhận.

Giới hạn phân giải của kính quang học được xác định bởi công thức Abbe: $d = \frac{\lambda}{2\,\mathrm{NA}}$ trong đó λ là bước sóng ánh sáng sử dụng, NA (numerical aperture) phản ánh khả năng thu sáng của vật kính. Độ phân giải càng cao khi λ nhỏ và NA lớn.

Chiếu sáng Kohler là phương pháp phổ biến để đồng nhất nguồn sáng, giảm bóng mờ và tăng tương phản. Kỹ thuật nhuộm đặc biệt (ví dụ HE, Giemsa) giúp phân biệt thành phần tế bào qua màu sắc, cải thiện độ tương phản cho mẫu sinh học.

Nguyên lý kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi điện tử thay thế photon bằng electron có năng lượng cao, đạt bước sóng hiệu dụng nhỏ hơn 0,01 nm, cho phép quan sát cấu trúc siêu nhỏ. Hệ thống bao gồm súng điện tử, ống phân tán electron, ống kính điện từ điều hướng và tập trung chùm electron.

TEM hoạt động bằng cách truyền chùm electron qua mẫu siêu mỏng (<100 nm). Phân bố electron xuyên qua mẫu phụ thuộc khối lượng nguyên tử và độ dày, tạo tương phản. SEM quét chùm electron trên bề mặt mẫu; electron thứ phát và electron phản xạ ngược được thu bởi detector để tái tạo ảnh ba chiều bề mặt.

• Chùm electron: năng lượng 80–300 keV, bước sóng cực nhỏ.
• Ống kính điện từ: hội tụ và điều chỉnh chùm electron giống thấu kính quang học.
• Detector: ghi nhận electron thứ phát, electron phản xạ ngược hoặc electron truyền qua.

Chuẩn bị mẫu quan sát

Đối với kính hiển vi quang học, mẫu sinh học cần được cố định để duy trì cấu trúc tế bào và mô. Chất cố định phổ biến là formalin 10% hoặc ethanol 70%, giúp ngưng tụ protein và ngăn phân hủy enzyme. Sau khi cố định, mẫu được khử nước qua chuỗi cồn tăng dần, sau đó tẩm mẫu trong sáp paraffin và cắt lát mỏng khoảng 4–10 µm bằng microtome.

Với kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), quy trình chuẩn bị mẫu phức tạp hơn do yêu cầu độ mỏng cực đại. Mẫu được cố định bằng glutaraldehyde và osmiun tetroxide, bào chế dưới chân không, tẩm nhựa epoxy và cắt siêu mỏng <100 nm bằng ultramicrotome. Cuối cùng, cắt lát được nhuộm bằng uranyl acetate và lead citrate để tăng tương phản electron.

• Khử nước: chuỗi cồn từ 50% đến 100%, tránh co ngót mẫu.
• Tẩm sáp/nhựa: paraffin cho quang học, epoxy cho TEM.
• Nhuộm màu: HE/Giemsa cho quang học; kim loại nặng cho TEM.

Kỹ thuật chụp và xử lý ảnh

Máy kính hiển vi hiện đại tích hợp camera CCD/CMOS để ghi lại hình ảnh trực tiếp. Quy trình bắt ảnh bao gồm hiệu chỉnh cân bằng trắng, độ phơi sáng và độ tương phản. Phần mềm chuyên dụng (ImageJ, Fiji) hỗ trợ đo kích thước, đếm mẫu và phân tích phân bố tín hiệu huỳnh quang qua plugin chuyên biệt.

Với TEM và SEM, tín hiệu electron thứ phát hoặc electron truyền qua được thu bởi detector chuyên dụng. Ảnh gốc thường chứa nhiễu và artefact, cần xử lý qua bộ lọc Gaussian, median hoặc thuật toán khử nhiễu phi tuyến. Sau đó, ảnh có thể ghép mosaic (stitching) để tạo trường nhìn rộng hoặc tái tạo 3D thông qua tomography.

Độ phóng đại và phân giải

Độ phóng đại của kính hiển vi quang học tính bằng tích của độ phóng đại vật kính và thị kính, thường dao động từ ×40 đến ×1000. Tuy nhiên độ phóng đại cao không đồng nghĩa với tăng phân giải nếu bị giới hạn bởi nhiễu xạ ánh sáng. Giới hạn Abbe chỉ ra phân giải tối đa khoảng 200 nm với ánh sáng xanh (λ ~500 nm) và vật kính NA ~1.4.

Kính hiển vi điện tử đạt độ phóng đại lên đến ×1 000 000 và phân giải sub-nanomet nhờ bước sóng electron ngắn. SEM cung cấp hình ảnh bề mặt với phân giải 1–10 nm, trong khi TEM có thể quan sát chi tiết cấu trúc tinh thể ở phân giải ~0,1 nm. AFM/SPM vượt lên tới 0,01 nm, cho phép khảo sát nguyên tử bề mặt mẫu vật liệu.

• Quang học: phóng đại tối đa ×1000, phân giải ~200 nm.
• SEM: phóng đại ×10 000–×500 000, phân giải ~1–10 nm.
• TEM: phóng đại ×100 000–×1 000 000, phân giải ~0,1 nm.
• AFM/SPM: không phóng đại, phân giải ~0,01 nm trên trục Z.

Ứng dụng chính

1. Sinh học tế bào và vi sinh: quan sát cấu trúc nội bào, phân loại vi khuẩn và virus. TEM phát hiện virus cúm, SARS-CoV-2; huỳnh quang xác định vị trí protein qua kháng thể gắn fluorophore.
2. Vật liệu và nano: khảo sát hạt nano, phân tích khuyết tật bề mặt vật liệu trong bán dẫn và chế tạo vật liệu composite.
3. Y khoa và mô bệnh học: chẩn đoán ung thư qua sinh thiết; SEM quan sát mô xương, răng; AFM khảo sát độ cứng và topography tế bào ung thư.
4. Công nghiệp bán dẫn: kiểm tra lỗi mạch tích hợp, định vị khuyết tật sérigraph, tối ưu hóa quy trình photolithography.

Hạn chế và thách thức

Kính hiển vi quang học bị giới hạn bởi hiệu ứng nhiễu xạ và tương phản thấp ở mẫu không nhuộm. Huỳnh quang có thể gây photobleaching, làm mất tín hiệu theo thời gian. Đối với TEM/SEM, quy trình chuẩn bị mẫu lâu và phức tạp, yêu cầu buồng chân không, dễ gây biến dạng mẫu do bức xạ electron.

Kỹ thuật AFM/SPM cho độ phân giải cao nhưng tốc độ quét chậm và dễ ảnh hưởng bởi rung động môi trường. Thiết bị đắt tiền và đòi hỏi bảo dưỡng nghiêm ngặt về nhiệt độ, độ ẩm và rung động. Ngoài ra, trình độ vận hành và phân tích dữ liệu cần nhiều thời gian đào tạo chuyên sâu.

• Giới hạn nhiễu xạ (quang học) và artefact (electron).
• Chuẩn bị mẫu phức tạp (TEM/SEM).
• Yêu cầu môi trường ổn định (AFM/SPM).
• Chi phí cao và đào tạo chuyên môn.

Xu hướng phát triển tương lai

Kính hiển vi siêu phân giải (STED, PALM/STORM) đã phá vỡ giới hạn Abbe, đạt phân giải đến $20\text{ nm}$ hoặc thấp hơn. Công nghệ multi-photon và light-sheet cho phép quan sát mẫu sống sâu trong mô với phototoxicity thấp.

Tích hợp trí tuệ nhân tạo giúp tự động nhận diện và phân loại cấu trúc trong hàng ngàn ảnh, giảm thiểu sai số do người vận hành. Fusion imaging kết hợp dữ liệu quang học và electron (CLEM) tạo ra hình ảnh đa thang độ, vừa ghi nhận chức năng sinh học vừa quan sát cấu trúc ultra-structure.

• Super-resolution: STED, PALM/STORM, SIM.
• Light-sheet microscopy: quan sát động học tế bào sống.
• AI & ML: phân tích ảnh tự động, phát hiện bất thường.
• CLEM: kết hợp quang học và điện tử trên cùng mẫu.

Danh sách tài liệu tham khảo

1. Nikon MicroscopyU. “Microscopy Basics.” https://www.microscopyu.com/microscopy-basics
2. Olympus Life Science. “Microscope Basics.” https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-basics
3. Murphy, D. B., & Davidson, M. W. (2012). Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. Wiley-Liss.
4. Thermo Fisher Scientific. “Electron Microscopy.” https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy.html
5. Hell, S. W. (2007). “Far-field optical nanoscopy.” Science, 316(5828), 1153–1158.